Il palazzo è stato la reggia di tre dinastie, i Medici, i Lorena e i Savoia, e solo in tempi moderni è stato destinato ad accoglieretre prestigiose collezioni: la Galleria Palatina, il Museo degli Argenti e la Galleria d'Arte moderna. Cosimo I, granduca di Toscana, acquistò il nucleo originale dell'edificio e vi fece aggiungere le due ali e la galleria di testa che formano il grande cortile d'onore, opera di Bartolomeo Ammannati. Il palazzo fu per circa tre secoli, cioè fino all'annessione del Granducato di Toscana al Regno d'Italia nel 1859, lo scenario degli avvenimenti più importanti della famiglia dei Medici e poi di quella degli Asburgo-Lorena a partire dal 1736.

La Galleria Palatina è ospitata, nella sua parte più importante, nelle sei sale di facciata del Palazzo Pitti e in quelle del retro, che formavano nell'ala nord l'appartamento d'inverno dei granduchi Medici. Passate in disuso, queste sale furono utilizzate per esporvi, a partire dalla fine del XVIII secolo, i dipinti più importanti (allora circa 500) presenti in Palazzo Pitti, in gran parte provenienti dalle raccolte della famiglia Medici.

Oggi la visita ha inizio dalla Galleria delle Statue, nella quale si trovano sculture antiche provenienti dalla Villa Medici di Roma, e dalla Sala detta del Castagnoli.
L'attigua ala detta del Volterrano era un tempo destinata all'appartamento delle granduchesse sin dall'epoca di Cosimo II de' Medici; in quell'appartamento nel 1743 morì l'ultima rappresentante della famiglia, Anna Maria Luisa, che lasciò al popolo fiorentino le sue vastissime collezioni d'arte.

La disposizione delle opere della Galleria Palatina segue i criteri estetici tipici delle quadrerie seicentesche.
Le magnifiche cornici intagliate formano un insieme organico e armonioso coi motivi ornamentali delle volte, realizzando quell'ideale dell'unità delle arti che è al centro dell'estetica barocca.

La Galleria fu ulteriormente ampliata quando i Savoia nel 1915 donarono l'intero palazzo al demanio pubblico; fu possibile così raddoppiare il numero dei quadri esposti. Le opere attualmente in mostra sono in buona parte provenienti dagli appartamenti privati dei vari membri della famiglia Medici. Numerosi i capolavori: La Madonna col Bambino ed episodi della vista di Sant'Anna di Filippo Lippi, databile intorno al 1450; la Madonna col bambino e san Giovannino di Raffaello (1516 circa) e, dello stesso artista, La Velata; il San Giovannino di Andrea del Sarto (1523); i celebri ritratti di Tiziano, di Veronese e di Tintoretto.